大多数三级安全柜的设计允许全天24小时工作。连续工作有助于控制实验室中灰尘和颗粒的水平。向房间中排风或通过套管接口与专门的排风管相连接的一级A1和A2型生物安全柜，在不使用时是可以关闭的。其他如二级B1和二级B2型生物安全柜，是通过硬管安装的，就必须始终保持空气流动以维持房间空气的平衡。
　　三级安全柜在开始工作以前以及完成工作以后，应至少让安全柜工作5分钟来完成"净化"的过程，应即应留在将污染的空气派出安全柜的时间。三级安全柜的所有维修工作应该由有资质的专业人员来进行。在三级安全柜操作中出现的任何故障都应该报告，并应在再次使用之前进行维修，每次实验结束后应对工作室进行清洗和消毒。
　　三级安全柜的维护工作：
　　1.预过滤器一旦受损，应及时更换。
　　2.空气过滤器有一定的使用寿命，随着使用期的延长，细菌和尘埃积聚在过滤器上，会导致空气过滤器压力损失的增大。空气过滤器的使用寿命到期后，应立即更换。由于过滤器可能带有污染物，操作时应注意安全防护，请专业人员来更换。
　　3.有下列情况时，应对三级安全柜进行现场检测：
　　·生物安全实验室竣工后，投入使用前，生物安全柜已安装完毕；
　　·生物安全柜被移动位置；
　　·对生物安全柜进行检修；
　　·生物安全柜更换过滤器后；
　　·生物安全柜一年一度的常规检测。